(一)方法原理 　　样品与硫酸一同加热消化,分解有机质,释放出的NH3与硫酸结合成硫酸铵留在溶液中.在定氮消化瓶中,用氢氧化钠中和硫酸铵生成氢氧化铵,加热又分解NH3,用硼酸吸收,用标定过的盐酸或硫酸滴定,从而计算出总氮量,换算为蛋白质量. 　　(二)仪器、设备 　　1.仪器 　　分析天平:感量0.0001克；实验用粉碎机；半微量凯氏蒸馏装置；半微量滴定管,容积10毫升；硬质凯氏烧瓶:容积25毫升,50毫升；锥形瓶:容积150毫升；电炉:600瓦. 　　2.试剂 　　(1)盐酸:分析纯,0.02mol/L,0.05mol/L标准溶液(邻苯二甲酸氢钾法标定)； 　　(2)氢氧化钠:工业用或化学纯,40%溶液(W/V)； 　　(3)硼酸:分析纯,2%溶液(W/V)； 　　(4)硼酸混合指示剂:溴甲酚绿0.1克,甲基红0.1克分别溶于95%乙醇中,混合后稀至100毫升,将混合指示剂与2%硼酸溶液按1:100比例混合,用稀酸或稀碱调节PH值为4.5,使呈灰紫色,此溶液放置时间不宜过长,需在1个月之内使用； 　　(5)加速剂:五水合硫酸铜(分析纯)10克,硫酸钾(分析纯)100克在研钵中研磨,仔细混匀,过40目筛； 　　(6)浓硫酸:比重1.84,无氮；双氧水:分析纯,30%；蔗糖:分析纯； 　　(7)双氧水硫酸混合液(简称混液):双氧水、硫酸、水的比例为3:2:1,即在100毫升蒸馏水中,慢慢加入200毫升浓硫酸,待冷却后,将其加入300毫升30%双氧水,混匀,此混液可一次配制500～1000毫升贮藏于试剂瓶中备用,夏天最好放入冰箱或阴凉处贮藏,室温(20℃)上下时不必冷藏,贮藏进间不超过1个月. 　　(三)操作步骤 　　1.样品的选取和制备选取有代表性的种子(带壳种子需脱壳)挑拣干净,按四分法缩减取样,取样量不得少于20克.将种子放于60～65℃烘箱中干燥8小时以上,用粉碎机磨碎,95%通过40目筛,装入磨口瓶备用. 　　2.称样称取0.1克试样两份(含氮1～7毫克),精确至0.0001克,同时测定试样的水分含量. 　　3.消煮1将试样置开25毫升凯氏瓶中,加入加速剂粉末.除水稻为1克外,其它均为2克.然后加3毫升硫酸,轻轻摇动凯氏瓶,使试样被硫酸湿润,将凯氏瓶倾斜置于电炉上加热,开始小火,待泡沫停止后加大火力,保持凯氏瓶中的液体连续沸腾,沸酸在瓶颈中部冷凝回流.待溶液消煮到无微小的碳粒并呈透明的蓝绿色时,谷类继续消煮30分钟,豆类继续消煮60分钟. 　　4.消煮2将试样置于50毫升凯氏瓶中,加入0.5克加速剂和3毫升混液,在凯氏瓶上放一曲颈小漏斗,倾斜在电炉上加热,开始小火(用调压器将电压控制在175伏左右),保持凯氏瓶中液体呈微沸状态.5分钟后加大火力(将电压控制在200伏左右).保持凯氏瓶中液体连续沸腾,消煮总时间,水稻、高粱为30分钟,其它均为45分钟. 　　注:消煮中列入两种消煮条件,经与国际谷物化学协会标准法(ICC)比较,t值测验均不显著,准确度与精密度也基本一致,在具体工作中可根据实际情况取其一种. 　　5.蒸馏消煮液稍冷却后加少量蒸馏水,轻轻摇匀.移入半微量蒸馏装置的反应室中,用适量蒸馏水冲洗凯氏瓶4～5次.蒸馏时将冷凝管末端插到盛有10毫升硼酸指示剂混合液的锥形瓶中,向反应室中加入40%氢氧化钠溶液15毫升(如采用消煮2的条件,加10毫升即可).然后通气蒸馏,当馏出液体积约达50毫升时,降下锥形瓶.使冷凝管末端离开液面,继续蒸馏1～2分钟,用蒸馏水冲洗冷凝管末端,洗液均需流入锥形瓶中. 　　6.滴定谷类以0.02mol/L,豆类以0.05mol/L标准盐酸或硫酸滴定至锥形瓶中的溶液由蓝绿色变成灰紫色为终点.空白用0.1克蔗糖代替样品作空白测定.消耗标准酸溶液的体积不得超过0.3毫升. 　　(四)结果计算 　　式中: 　　V2滴定试样时消耗标准酸的体积(毫升) 　　V1滴定空白时消耗标准酸的体积(毫升) 　　N标准酸溶液的浓度(mol/L) 　　K氮换算成粗蛋白质的系数 　　W试样重量(克) 　　X试样水分含量 　　0.0140每毫摩尔氮的克数 　　平行测定的结果用算术平均值表示,保留小数后二位. 　　两份试样粗蛋白质的平行测定结果为15%以下时,其相对相差不得大于3%；15%～30%进为2%；30%以上为1%. 　　凯氏定氮法中的常量,微量,和半微量区别： 　　区别在于检测用样品量,你可以按标准进行操作,没有必要拘泥于某一方法 　　主要看你样品量是否足够 　　1、常量由于可以把全部消化液一同蒸馏测定,故较适合蛋白质含量低的样品. 　　2、微量、半微量差别在装置上,二者皆属于水蒸汽蒸馏操作,只是前者把蒸汽直接导入反应室内,后者把蒸汽导入反应室外加热,由于二者皆取消化液的一部份操作,可平行蒸馏操作,但检测限要较常量法高. 　　3、纯粹从回收率的角度看,半微量要稍好.